Nato a Roma dalla famiglia patrizia Anicia, fu pretore nel 573, poi, datosi a vita contemplativa, fondò sei monasteri in Sicilia ed uno a Roma, dove si ritirò. Da papa Pelagio II venne mandato nunzio apostolico a Costantinopoli. Quando fu eletto papa, Roma era minacciata da due nemici: la carestia e i Longobardi. Gregorio fece venire grani dalla Sicilia, e fece preparativi di guerra mentre avviava trattative con gl'invasori , coi quali riuscì a concludere un vantaggioso trattato, valendosi dell'appoggio della regina Teodolinda, moglie di Agilulfo. Liberatosi così da ogni pericolo da parte dei Longobardi, combatté con energia i Donatisti in Africa e i Simoniaci nella Gallia, si adoperò a diffondere la regola di S. Benedetto fra i monaci, a riformare i costumi del clero secolare, e mandò a convertire gli Anglosassoni (595-597). In Oriente, non poté impedire al patriarca di Costantinopoli, Giovanni il Digiunatore, protetto dall'imperatore Maurizio, di assumere il titolo di vescovo ecumenico. Si occupò anche del rito e del culto; fece riunire tutte le preghiere che servono per la messa e per amministrare i sacramenti e compose l'Antifonario. Istituì inoltre una scuola di canto, che da lui si disse gregoriano.
Gregorio I morì a 64 anni, lasciando un numero considerevole di opere, trentacinque libri di morale sopra Giobbe, i Dialoghi, il Pastorale, tredici volumi di Lettere, il Sacramento e il già citato Antifonario. Il complesso di queste opere costituisce un monumento importantissimo per la storia ecclesiastica.